|
|
Biotechnologické využití rostlinných virů
Vaculík, Petr
Model terciární struktury kapsidového proteinu X viru bramboru (PVX CP) byl využit jako předloha pro navržení nových pozic pro vkládání antigenů za účelem jejich prezentace na povrchu částic PVX. Na základě tohoto modelu bylo vybráno sedm pozic (A-G), které se nacházejí na povrchu virionu. Jako antigen pro prezentaci byl použit 17 aminokyselinový epitop onkoproteinu E7 odvozený od lidského papilomaviru typu 16 (E7 epitop) ve fúzi s 6xHis kotvou nebo StrepII kotvou, a to v obou možných uspořádáních (6xHis-E7, E7-6xHis, StrepII-E7 a E7-StrepII). Modifikované PVX CP byly nejprve exprimovány v Escherichia coli MC1061, kde docházelo k tvorbě virových částic pouze v případě vložení inzertů StrepII-E7 a E7-StrepII do pozice A v PVX CP. Výsledky z transientní exprese modifikovaných PVX CP v Nicotiana benthamiana prokázaly, že nejvhodnější pozice pro prezentaci antigenů je pozice A, která je situovaná mezi 24. a 25. aminokyselinou v PVX CP. Dále bylo zjištěno, že virové částice mohly být detekovány pouze v přítomnosti StrepII kotvy a že stabilita těchto částic je ovlivněna uspořádáním inzertu (StrepII-E7 vs. E7-StrepII), neboť bylo možné purifikovat pouze virové částice nesoucí inzert v uspořádání E7-StrepII. Kromě využití PVX pro přípravu antigen prezentujícího systému byl také posouzen vliv infekce PVX na...
|
|
|
Biotechnologické využití rostlinných virů
Vaculík, Petr ; Čeřovská, Noemi (vedoucí práce) ; Ryšánek, Pavel (oponent) ; Petrzik, Karel (oponent)
Model terciární struktury kapsidového proteinu X viru bramboru (PVX CP) byl využit jako předloha pro navržení nových pozic pro vkládání antigenů za účelem jejich prezentace na povrchu částic PVX. Na základě tohoto modelu bylo vybráno sedm pozic (A-G), které se nacházejí na povrchu virionu. Jako antigen pro prezentaci byl použit 17 aminokyselinový epitop onkoproteinu E7 odvozený od lidského papilomaviru typu 16 (E7 epitop) ve fúzi s 6xHis kotvou nebo StrepII kotvou, a to v obou možných uspořádáních (6xHis-E7, E7-6xHis, StrepII-E7 a E7-StrepII). Modifikované PVX CP byly nejprve exprimovány v Escherichia coli MC1061, kde docházelo k tvorbě virových částic pouze v případě vložení inzertů StrepII-E7 a E7-StrepII do pozice A v PVX CP. Výsledky z transientní exprese modifikovaných PVX CP v Nicotiana benthamiana prokázaly, že nejvhodnější pozice pro prezentaci antigenů je pozice A, která je situovaná mezi 24. a 25. aminokyselinou v PVX CP. Dále bylo zjištěno, že virové částice mohly být detekovány pouze v přítomnosti StrepII kotvy a že stabilita těchto částic je ovlivněna uspořádáním inzertu (StrepII-E7 vs. E7-StrepII), neboť bylo možné purifikovat pouze virové částice nesoucí inzert v uspořádání E7-StrepII. Kromě využití PVX pro přípravu antigen prezentujícího systému byl také posouzen vliv infekce PVX na...
|
|
|
Biotechnologické využití rostlinných virů
Vaculík, Petr
Model terciární struktury kapsidového proteinu X viru bramboru (PVX CP) byl využit jako předloha pro navržení nových pozic pro vkládání antigenů za účelem jejich prezentace na povrchu částic PVX. Na základě tohoto modelu bylo vybráno sedm pozic (A-G), které se nacházejí na povrchu virionu. Jako antigen pro prezentaci byl použit 17 aminokyselinový epitop onkoproteinu E7 odvozený od lidského papilomaviru typu 16 (E7 epitop) ve fúzi s 6xHis kotvou nebo StrepII kotvou, a to v obou možných uspořádáních (6xHis-E7, E7-6xHis, StrepII-E7 a E7-StrepII). Modifikované PVX CP byly nejprve exprimovány v Escherichia coli MC1061, kde docházelo k tvorbě virových částic pouze v případě vložení inzertů StrepII-E7 a E7-StrepII do pozice A v PVX CP. Výsledky z transientní exprese modifikovaných PVX CP v Nicotiana benthamiana prokázaly, že nejvhodnější pozice pro prezentaci antigenů je pozice A, která je situovaná mezi 24. a 25. aminokyselinou v PVX CP. Dále bylo zjištěno, že virové částice mohly být detekovány pouze v přítomnosti StrepII kotvy a že stabilita těchto částic je ovlivněna uspořádáním inzertu (StrepII-E7 vs. E7-StrepII), neboť bylo možné purifikovat pouze virové částice nesoucí inzert v uspořádání E7-StrepII. Kromě využití PVX pro přípravu antigen prezentujícího systému byl také posouzen vliv infekce PVX na...
|
|
|
Heterologní exprese onkoproteinu E7 lidského papilomaviru (HVP 16)
Lidický, Ondřej ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Mach, Otakar (oponent)
Rodící se technologie produkce vakcín a farmaceutických proteinů v rostlinách nabízí do budoucna veliký potenciál pro jejich levnou, bezpečnou a kvalitní průmyslovou výrobu. Tato práce je zaměřena na studium možnosti optimalizace přípravy experimentální terapeutické vakcíny proti lidskému papilomaviru typu 16 (HPV 16). Experimentální vakcína je tvořena virovými částicemi X viru bramboru (PVX), od kterého byl odvozen virový vektor použitý pro transientní expresi konstruktů, které mají na svém povrchu navázaný onkoprotein HPV- E7. Tyto chimerické virové částice by měly být schopné aktivovat silnou a specifickou buněčnou imunitní odpověď. Modifikace kapsidového proteinu PVX takto velikým inzertem může mít vliv na schopnost viru tvořit částice. V této práci jsme charakterizovali některé vlastnosti tohoto chimerického viru jako je rozpustnost nebo schopnost viru šířit se v infikované rostlině.
|
|
|
Mutační analýza obalového proteinu X viru bramboru (PVX)
Werschallová, Markéta ; Ryšánek, Pavel (vedoucí práce) ; Jan, Jan (oponent)
Předkládaná diplomová práce se zabývá mutační analýzou konzervovaných aminokyselin obalového proteinu (CP, coat protein) X viru bramboru (PVX, Potato virus X), kterou má být zjištěna důležitost vybraných aminokyselin pro šíření viru v rostlině. Jako pokusné rostliny byly vybrány tabáky Nicotiana benthamiana. Modifikace v obalovém proteinu byly provedeny na základě porovnání aminokyselinové sekvence obalového proteinu PVX s CP viru mozaiky papáji (PapMV CP, Papaya mosaic virus coat protein), zatím jediného zástupce potexvirů, kam patří i PVX, s popsanou krystalovou strukturou obalového proteinu, u kterého byla experimentálně potvrzena důležitost určitých aminokyselin pro interakci podjednotek obalového proteinu CP,CP PapMV a CP,RNA a tím i pro tvorbu virových částic. Z databáze National Center for Biotechnology Information (NCBI) byly získány dostupné aminokyselinové sekvence izolátů a kmenů PVX CP, které byly porovnány mezi sebou, ale i se sekvencí PVX využívanou v Laboratoři virologie ÚEB, AV ČR v. v. i. Jako konzervované pozice byly určeny kodóny kódující fenylalanin a lysin v pozici 33 a 118 obalového proteinu, které byly mutovány pomocí metod molekulární biologie.
Celkem bylo vytvořeno 5 konstruktů mutantů obalového proteinu, 2 deleční mutanti N- konce PVX CP, kteří byli vytvořeni ve vektoru odvozeném od PVX (pGR106), ve kterém je integrována cDNA sekvence PVX, zbylí 3 bodoví mutanti byli vytvořeni pouze jako produkt SOE PCR. Do delečních mutantů, u nichž byla odstraněna větší část N- koncové sekvence CP, přesněji sekvence mezi 2.,32. a 2.,33. kodónem, byl zaklonován vytvořený reportérový gen GFP pro sledování nástupu signálu infekce a šíření mutantů v rostlinných pletivech. Ve výsledku se oba mutanti šířili pouze z místa agroinfiltrace do okolních buněk inokulovaného listu. Rozdíl byl zaznamenán jak v rychlosti nástupu signálu GFP, tak i v míře rozšíření mutantů do okolních buněk. Deleční mutant s ponechaným kodónem pro F33 vykazoval jednak rychlejší nástup signálu, ale byl schopen se šířit mnohem rychleji a výrazněji do okolních buněk, ale pouze v rámci inokulovaného listu, zatímco u delečního mutanta s odstraněným kodónem pro F33 byl zaznamenán pomalejší nástup signálu a menší schopnost infikovat okolní buňky. Dále byli vytvořeni bodoví mutanti, deleční a substituční, konkrétně deleční mutant kodónu F33 (delece F33), substituční mutant, u kterého byl kodón fenylalaninu v pozici 33 nahrazen kodónem alaninu (F33A) a substituční mutant, u kterého byl kodón lysinu v pozici 118 nahrazen kodónem alaninu (K118A). Bohužel se nepodařilo bodové mutanty úspěšně vložit do vektoru pGR106, tudíž nebylo možné je zhodnotit v rostlinách N. benthamiana.
Z uvedených výsledků lze usuzovat na důležitost aminokyseliny F33 při mezibuněčném pohybu v rámci sousedních buněk. Pro posouzení důležitosti F33 a K118 v systémové infekci by bylo nutné zhodnotit i bodové mutanty delece F33, F33A a K118A.
|
host ::
RSS.